노지 양채류는 배추, 양배추, 녹색꽃양배추 등이 주종을 이 루고 있는데, 이 세 종을 모두 가해하는 대표적인 해충이 복숭 아혹진딧물(Green peach aphid, Myzus persicae)이다. 복숭아혹 진딧물은 국내에서는 물론 전 세계적인 주요 해충으로 식물 조 직을 흡즙하여 잎의 위축, 성장률의 둔화 및 수확량의 감소 등 직접적인 피해와 100여종의 각종 식물 바이러스병의 매개 및 2 차적인 그을음병의 유발 등의 간접적인 피해를 준다고 알려져 있다(Lee and Paik, 1977). 복숭아혹진딧물 이외에 무테두리진 딧물(Turnip aphid, Lipaphis erysimi), 양배추가루진딧물(Cabbage aphid, Brevicoryne brassicae) 역시 많은 피해를 주고 있으나 (Lee and Paik, 1977; Shim et al., 1977), 이 중에서 배추에 가장 심한 피해를 주는 것은 복숭아혹진딧물이라 할 수 있다(Ahn et al., 1989). 국내에서 복숭아혹진딧물의 살충제 저항성 문제는 1970년대 이후 꾸준히 보고되었다(Shim et al., 1977; Choi and Kim, 1986; Choi et al., 1989; Choi et al., 2001). 국내뿐만 아니 라 전세계적으로 저항성 문제가 심각 한데(Devonshire; Foster et al., 2008; Puinean et al., 2010), 농민들이 현장 에서 느끼는 저항성 이라 함은 추천농도로 살포했을 때 방제에 어려움을 겪을 정도로 살충력이 현저히 떨어진 경우라고 판단 된다. 농민들이 피부로 느끼고 있는 살충제 저항성은 약제의 오 남용이 가장 주된 요인이라고 할 수 있으며(Choi and Kim, 1986; Choi et al., 2001), 그에 따른 환경오염과 안전한 먹거리 생산에 큰 악영향을 미친다. 이러한 이유로 살충제 저항성 관리 체계 구축은 매우 중요한데, 1970년대 이후로 유기인계, 카바 메이트계의 저항성이 보고되었고, 피레스로이드계 약제 사용 이 급속히 증가하면서 1980년대에는 세 계통의 약제에 대한 저 항성 수준이 매우 급격하게 증가 하였다(Choi and Kim, 1986; Choi et al., 1989). 이 세 계통의 약제는 현재도 사용되고 있는 약제이기 때문에 저항성 관리를 위한 시스템 구축이 반드시 필 요하다. 저항성 발달 정도를 효율적으로 탐지하기 위해 최근 비 용과 시간이 많이 소요되는 생물검정을 대체할 수 있는 분자생 물학적 진단 기술을 많이 개발하고 있다(Anstead et al., 2004; Cassanelli et al., 2005). 따라서 본 연구는 복숭아혹진딧물의 주요 양채류 재배 지역별 살충제 저항성 수준을 조사하고 우수 약제를 선발하여 저항성 관리 체계의 기초 자료로 제공하고자 수행되었으며, 또한 생물검정을 대체 할 수 있는 저항성 마커를 개발하여 야외 개체군 저항성 관리에 활용하고자 수행되었다.

재료 및 방법

시험 곤충

복숭아혹진딧물 살충제 감수성 계통은 국립농업과학원에 서 분양 받았으며, 지역별로 채집한 야외 집단은 양채류 재 배가 많이 이루어지고 있는 홍천(홍천군 내면), 평창(평창군 대관령면), 봉화(봉화군 석포면), 무주(무주군 무풍면), 제주 (서귀포시 대정읍)에서 2009년에서 2011년까지 3년 간 6~8월 사이에 채집하여 배추를 기주로 고령지농업연구센터 곤충사 육실(온도 25°C, 광주기 16L: 8D, 상대습도 60±10%)에서 사 육하였다.

생물검정 및 복합저항성 계통 선발

2009년 기준 한국작물보호협회에 등록된 살충제 21가지(배 추 기준) 중 단일 제제로 구성된 10개의 약제를 선발하고 시중에 서 판매하고 있는 약제를 구입하여 시험에 사용하였다(Table 1). 시험 방법은 잎침지법을 사용하였으며, 추천농도로 희석된 살 충제에 5 cm로 자른 배추잎을 30초간 침지 후 음건하여 여과지 가 깔린 5.5 cm 디쉬에 넣은 후 성충 10 마리씩 접종 후 48 시간 후 사충수를 조사하였다. 모든 실험은 농도별 3반복으로 수행 하였으며 사충률을 계산하여 저항성 정도를 비교하였다.

복합저항성 계통은 5개의 야외 지역 채집 개체군 내에서 100 마리씩을 모아서 하나의 사육 상자에 넣은 후 1주일 후 선발을 시작 하였다. 사용된 살충제 계통별 저항성 정도가 높은 메소밀 (카바메이트계), 비펜스린(페레스로이드계), 이미다클로프리드 (네오니코티노이드계)와 페메트로진, 플로니카미드를 각각 LC₂₀ 값에 준하여 6개월 간 한달 간격으로 총 6회 도태하여 복합저항 성 계통(multiple resistance strain - MR)을 만들어서 저항성 기 작 연구에 중점적으로 사용하다. 도태 계통을 고정 한 후 한 달 에 1회 도태를 지속하면서 저항성 계통을 유지하였다. 생물 검 정은 위와 동일한 방법으로 수행하였으며, LC₅₀값은 SAS 프로 그램을 이용하여 probit 방법을 사용하였다(SAS institute, 2009).

지역별 복숭아혹진딧물 약제 저항성 유전자 형질 빈도 조사

복숭아혹진딧물 약제 저항성에 관여하는 것으로 알려진 유 전자의 돌연변이 유무를 확인하기 위하여 개체군 및 계통별 전 체 DNA를 추출하였다. 각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성 충을 20 mg 정도 분량씩 모은 다음 DNAzol (MRC, Cincinnati, OH, USA) 400 μl를 넣고 조직분쇄기를 이용하여 균질화 하였 다. 이후 과정은 MRC사에서 제공하는 방법에 따라 DNA를 추 출하였다. 추출된 DNA는 20 μl 기준 PCR 수행 시 50 ng 정도 를 넣었다. 주형 DNA 1 μl, 0.5 pM 프라이머 1 μl씩, 10 X PCR 완충용액, dNTP (각각 최종 농도가 0.2 mM), ExTaq (TaKaRa, Shiga, Japan)을 넣고 total volume을 20 μl로 맞추어 PCR을 수 행하였다. PCR조건은 94°C 4분간 변성과정을 거쳐 94°C 20초, 55°C 20초, 72°C 30초로 35회 반복하여 증폭하였고 마지막에 72°C에서 5분간 처리하였다. 사용된 프라이머는 Table 2와 같다. PCR 산물은 전기영동으로 확인 후 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up kit (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 정제, 농축하였다. 실험 방법은 kit에서 제공하는 방법을 따랐다. 정 제, 농축된 PCR산물의 염기서열을 분석하였다(NICEM sequencing facility, Seoul National University, Seoul, Korea). 염기서열 분 석 결과는 Lasergene software (DNASTAR, Madison, WI, USA)를 이용하여 Clustral V방법으로 정렬하고 분석하였다.

저항성 관여 에스터레이즈 동위 효소(esterase isozyme) 분석

각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성충을 500 mg 정도 분 량씩 모은 다음 0.1% Triton X-100가 포함된 0.1 M Tris-HCl pH 7.8 완충용액 500 μl를 넣고 얼음 에서 조직분쇄기를 이용 하여 균질화 한 후 약 10,000 g로 4°C에서 20분간 원심분리 하 였다. 원심분리 후 상층액을 지질 제거를 위하여 Wizard® SV gel and PCR clean-up kit에서 제공하는 칼럼에 넣고 7,000 g로 4°C에서 5분간 원심분리 하였다. 칼럼을 통과한 용액을 Bradford 방법(Bradford, 1976)으로 단백질정량 한 후 단백질 원으로 사용하였다.

추출된 단백질 시료(10 μg)를 비변성전기영동과 등점전전 기영동으로 단백질 분리를 실시하였다. 비변성전기영동은 수직 전 기영동 장치(Novex mini cell, X-cell sure lock, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였으며, 4°C에서 120 V로 90분간 분리하 였다. 두 장의 젤 중 한 장은 Coomassie Blue R-250을 이용하여 염색을 하였으며, 나머지 한 장은 에스터레이즈 활성염색으로, 1 mM alpha naphthyl-acetate, butyrate, propionate, valerate 용 액에 5분간 반응시킨 후 0.2% fast blue RR salt 용액에 밴드가 보 일 때까지 반응시킨 후 세척하였다. 등전점전기영동은 pH 3-7 pre-cast IEF gel (Novex)과 비변성전기영동을 수행한 전기영동 장치를 이용하였으며 음극 완충용액은 20 mM lysine, 20 mM arginine을 양극 완충용액은 7 mM phosphoric acid를 각각 사 용하였다. 분리 조건은 4°C에서 100 V 60분, 200 V 60분, 500 V 30 분이었다. 분리 후 젤을 0.1 M Tris-HCl pH 7.8 완충용액에 10분간 넣어 단백질을 복원 시킨 후 동일한 방법으로 에스터레이즈 활성 염색을 하였다.

결과 및 고찰

지역별 복숭아혹진딧물 약제 저항성 모니터링 및 저항성 계통 도태

2009년에서 2011년까지 3년간 양채류 재배가 많이 이루어 지고 있는 다섯 지역의 복숭아혹진딧물 약제 저항성 수준을 모 니터링 한 결과 일부 약제에 대해서는 저항성 수준이 매우 높았 다(Table 3). 2009년에는 양채류 재배가 많이 이루어지고 있는 홍천, 평창, 봉화, 무주, 제주 지역 개체군 대부분 메소밀, 비펜스 린 등에 대하여 고도의 저항성을 보였으나 2010년에는 지역에 따라 차이가 컸다. 2011년에는 메소밀에 대해 낮은 정도의 저항 성을 보인 반면에 비펜스린에 대해 고도의 저항성을 보이는 등 지역별, 약제별 저항성 정도의 차이가 컸다. 네오니코티노이드 계통의 약제(이미다클로프리드, 아세타미프리드, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 클로티아니딘, 디노테퓨란)가 대체적으로 좋은 살충효과를 나타냈지만, 2011년에는 지역에 따라 디노테퓨란의 경우 저항성 차이가 컸으므로 방제 약제를 선택할 때 주의를 기울 여야 할 것이다. 또한, 지역 개체군에서 꾸준하게 도태를 시킨 복 합저항성 계통(MR)은 감수성에 비하여 다양한 약제에 대해 높 은 저항성을 나타냈다(Table 4). 이는 야외 개체군에서도 다양한 약제에 대하여 복합적으로 저항성을 보일 수 있다는 것이다.

복숭아혹진딧물 약제 저항성 유전자 형질 빈도 조사

3년간 실험에 사용된 5가지 야외 계통에서 저항성을 보인 메 소밀과 비펜스린의 작용점으로 알려진 아세틸콜린에스터레이 즈(ace; StoF)와 나트륨채널(para; LtoF)에 이미 보고된 돌연 변이 분포를 알아본 결과 ace에서는 야외 계통 모두 돌연변이 가 분포하고 있으나 para의 경우 높은 저항성을 보였음에도 불 구하고 돌연변이가 거의 나타나지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과 는 외국에서 보고된 결과(Cassanelli et al., 2005)와 상당한 차 이가 있을 뿐만 아니라 생물검정 결과와 정 반대의 결과를 보여 외국에서 보고된 결과를 그대로 인용하기에는 문제가 있을 것 으로 사료된다. 외국에서 발표된 일부 논문에서는 복숭아혹진 딧물의 ace의 StoF, para의 LtoF 돌연변이를 좋은 저항성 마커 로 활용하기위해 분자생물학적 진단법을 개발하기도 하였으나 (Anstead et al., 2004; Cassanelli et al., 2005), para의 LtoF의 경 우 생물검정 결과와 상관관계가 없어 국내에서는 적용하기 어려 울 것으로 판단한다. 또한, 본 연구를 통하여 복숭아혹진딧물 para에서 LtoF 돌연변이가 발견되는 부근에서 새로운 점돌연변 이인 MtoL 돌연변이를 발견하였다. 이 돌연변이는 최초 목화진 딧물에서 발견되었으나(Yang and Williamson, 2001), 최근 프랑 스 야외 계통에서도 발견된 예가 있다(Fontaine et al., 2011). 이는 국외의 계통들에서 보이는 돌연변이가 국내 지역 개체군에 똑같이 적용할 수 없는 경우를 보여주는 중요한 사례이다. 이러한 사례는 국 내 현실에 맞는 분자 마커 개발의 중요성을 확인시켜주고 있다.

국내 뿐만 아니라 외국에서도 진딧물 방제 약제로서 네오니 코티노이드 계통을 많이 사용하고 있는데(Nauen et al., 2008), 현재까지 국내에서는 외국에서 보고된 정도의 고도 저항성을 보이지는 않고 있다(Choi et al., 2001). 외국의 예를 들면, 프랑 스 남부 지방에서 채집된 복숭아혹진딧물 FRC계통에서 이미다 클로프리드에 대해 1,679배의 저항성을 보였으며, 기타 네오니 코티노이드 계통 약제에 교차 저항성을 보였고, 이 계통의 약제 작용점으로 알려진 nAChR beta1 subunit 내 RtoT 돌연변이가 존재함을 확인하였다(Bass et al., 2011b). 돌연변이 이외에도 cytochrome P450의 과별현 역시 주요 저항성 기작으로 보고된바 있다(Puinean et al., 2010). 그러나 본 연구를 통하여 국내에서는 1,000배 이상 고도 저항성을 보이는 개체군은 찾을 수가 없었 고, 다만 MR이 감수성에 비하여 약 200배 정도의 저항성을 보 였을 뿐이다. 다만, 2000년대 초 보다는 야외 개체군 내 이미다 클로프리드 저항성 수준이 많이 발달된 것을 확인하였다(Choi et al., 2001). 이미 보고된 RtoT돌연변이는 MR은 물론 이미다 클로프리드에 저항성 정도가 상대적으로 높았던 2011년 제주, 홍천 등의 계통에서 발견되었다. 조사된 3년 동안의 야외 개체 군에 대해 돌연변이 유무를 확인하고자 하였으나 유전체DNA (genomic DNA, gDNA) 상에서는 인트론 때문인지 PCR이 잘 되지 않아 2011년 채집된 일부 개체군을 제외하고는 돌연변이를 검출할 수 없었다(Fig. 1). 다만, 2012년에 채집된 야외 개체군에 서도 일부 돌연변이가 발견되는 것으로 보아 앞으로 네오니코 티노이드 계통의 약제에 대한 고도의 저항성 개체군이 발생할 우려가 있을 수 있다. 또한 외국에서 보여지는 RtoT 돌연변이가 1,000배 이상의 고도의 저항성에서 만 발견되었을 뿐만 아니라 200배 정도의 중도 저항성에서 발견된 것은 국내 복숭아혹진딧 물에서는 RtoT돌연변이가 para에서의 LtoF와 같이 외국과는 다른 양상인 것으로 추정된다.

지역별 복숭아혹진딧물 에스터레이즈 동위효소(esterase isozyme) 분석

복숭아혹진딧물 저항성 발달에 에스터레이즈(E4, FE4 type esterase)가 관여하는 것으로 알려져 있는데(Field and Devonshire, 1998), 주로 유전자의 중복(gene duplication)에 따른 수적 증가 와 유전자의 과발현(over-expression)에 의한 양적인 증가이다 (Field and Foster, 2002). 본 연구에서 에스터레이즈의 양적 증 가여부를 조사한 결과, 복합저항성 계통과 지역계통 특이적 동 위효소(isozyme)의 발현정도는 지역 간에 차이가 있었으나, 사 용한 4개의 기질간의 차이는 거의 없었다 (Fig. 2). 사용한 α -NA, NP, NB, NV 4개의 기질은 곁사슬이 각각 1~4개로 곁사 슬이 길어질수록 에스터레이즈가 가수분해되기 어려워져 곁사 슬 길이에 따른 분해능 차이를 볼 수 있다(Barron and Bernsohn, 1968). 일부 논문에서는 특정 에스터레이즈 동위효소의 과발 현을 저항성 발달의 판단 기준으로 삼기도 하였으나(Field et al., 1999; Field et al., 1996), 정량화가 어려워 본 연구에서는 특정 살충제에 대한 저항성 마커로 활용하기는 어려웠다. 추가 연구로 다양한 살충제에 대하여 저항성을 보이는 MR에서 특 이적으로 발현되는 유전자를 찾고자 suppression subtractive hybridization 방법으로 cDNA library를 만들어 분석한 결과 cDNA library 중 480개를 분석하여 213,867 bp의 염기서열을 읽었다. 유효한 결과를 얻은 것은 154개로 에스터레이즈 등 잘 알려진 살충제 저항성 관여 유전자뿐 만 아니라 ABC transporter 등의 유전자도 검출하였으나, cDNA library 내 검출 비율을 기 준으로 평가 하였을 때, 발현량의 차이가 매우 낮은 것으로 판 단되었다(미보고자료). 이러한 해독 관련 유전자의 발현량을 기준으로 저항성을 판단하는 경우는 에스터레이즈 외에도 P450 등의 유전자가 있기는 하나(Bass et al., 2011a; Karunker et al., 2008; Puinean et al., 2010), 에스터레이즈와 같이 정량화가 어려워 본 연구에서는 마커로 활용 하기에는 어려움이 있었다.

위의 결과를 종합해 보면, 살충제에 대한 지역별, 시기별 저 항성 정도가 다르기 때문에 정확하게 저항성 정도를 모니터링 한 후 약제 방제 체계를 수립 한다면 훨씬 더 효과적인 방제로 약 제비 절감 효과를 얻을 수 있을 것이다. 그러나 생물 검정의 경 우 많은 시간과 노력이 필요하기 때문에 빠른 시간 내에 저항성 모니터링을 할 수 있는 방법이 필요한데, PCR을 활용 한 분자 생물학적인 방법이 그 대체 방법으로 제시 되어왔다(Aketarawong et al., 2011; Clark et al., 2001; Kim et al., 2007; Kim et al., 2012; Kim and Kwon., 2011; Kwon et al., 2004). 따라서 국내 복숭아혹진딧물 살충제 저항성관리를 위하여 본 연구를 통해 선발된 저항성 마커를 활용한다면 더 효율적인 관리가 가능 할 것이다.