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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.64 No.4 pp.231-242
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2025.09.0.029

Functional Importance of Epidermal Chitinases and Lytic Polysaccharide Monooxygenases in Chitinous Cuticle Degradation During Insect Molting

Yasuyuki Arakane, Mi Young Noh1*
Department of Applied Biology, Institute of Environmentally Friendly Agriculture (IEFA), Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
1Department of Forest Resources, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
*Corresponding author:annemi@chonnam.ac.kr
June 18, 2025 September 3, 2025 September 12, 2025

Abstract


Insect exoskeleton or cuticle is an extracellular matrix primarily formed from the linear structural polysaccharide chitin and cuticular proteins, which serves as skin and skeleton, protecting them from environmental stresses, mechanical damage and pathogenic microorganisms. However, insects must periodically replace their old cuticle with a new one in a vital physiological process called ‘molting and ecdysis’ to accommodate their continuous growth and development. During each molting process, in addition to deposition of new cuticle, the old cuticle must be degraded simultaneously. Many studies have demonstrated that certain chitinases (CHTs) and β-N-acetylglucosaminidases (NAGs) present in molting fluid play roles in cuticular chitin degradation. Beside these chitinolytic enzymes, recent studies have indicated that lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), which oxidatively cleave glycosidic bonds in the crystalline chitin fibers, are also critical for turnover of the old cuticle. Here, we review the functional importance of the CHTs and LPMOs and provide new insight into the molecular mechanism of cuticular chitin degradation required for completion of insect molting.


cuticle/exoskeleton , chitin , molting/ecdysis , chitinases (CHT) , lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO)

곤충의 탈피 과정에서 키틴성 표피 분해에 관여하는 chitinases와 lytic polysaccharide monooxygenases의 생리학적 기능

Yasuyuki Arakane, 노미영1*
전남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과
1전남대학교 농업생명과학대학 산림자원학과

초록


곤충의 외골격/표피(exoskeleton/cuticle)는 구조 다당류인 키틴(chitin)과 큐티클 단백질(cuticle proteins)로 이루어진 세포외기질(extracellular matrix)로서 외부 환경스트레스, 물리적 손상과 병원성 미생물 등으로부터 자신을 보호하는 피부와 골격의 역할을 한다. 그러나 곤충은 원래 가지고 있던 표피를 분해하고, 새로운 표피로 교체하는 ‘탈피(molting 또는 ecdysis)’를 주기적으로 거쳐야 정상적인 성장과 발달을 할 수 있다. 따라서, 곤충은 탈피 과정마다 원래 가지고 있던 표피 일부를 분해하는 동시에 안쪽에는 새로운 표피를 생성한다. 이 과정에서 탈피액에 있는 키틴을 가수분해하는 효소인 chitinases (CHTs)와 N-acetylglucosaminidases (NAGs)가 오래된 표피(old cuticle)의 키틴 섬유를 분해하는 데 중요한 역할을 한다. 최근에는 이들 chitinolytic enzyme들과 함께 lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)가 키틴의 glycosidic bonds를 산화적으로 절단하여 오래된 표피를 효과적으로 분해한다는 것이 새롭게 밝혀져 주목을 받고 있다. 본 종설에서는 곤충의 탈피 과정에서 CHTs와 LPMOs의 생리학적 기능을 기술하고, 오래된 표피의 결정성 키틴을 분해하는 과정에 대한 새로운 분자 기작을 소개하고자 한다.


외골격/표피 , 키틴 , 탈피 , 키틴분해효소 , 용해성 다당류 모노옥시게나아제

    곤충 표피의 구조와 주요 구성 물질

    곤충의 생존에 필수적 역할을 하는 표피는 몇 가지 기능성 층으로 이루어져 있다(Fig. 1) (Locke, 2001). 일반적으로 가장 바깥쪽에 존재하는 얇은 층은 외피(envelope)이며, 주로 지질과 지질단백질, hydrocarbons로 이루어진 waxes와 wax esters, free fatty acids, alcohols, triacylglycerides 및 sterols과 같은 다양한 물질로 이루어져 있어 수분 증발을 막아주는 역할을 한다. 외피의 바로 아래쪽은 외표피(epicuticle) 층으로 경화에 중요한 phenolics 물질과 단백질들이 높은 농도로 존재한다. 가장 안쪽은 표피의 가장 두꺼운 층인 원표피(procuticle)가 존재한다. 원표피는 다시 형태적으로 구별되는 외원표피(exocuticle)와 내원표피(endocuticle)로 나누어진다. 외원표피는 일반적으로 탈피 이전에 형성되는 층으로 색소화가 이루어져 어두운 색을 띠며 상대적으로 단단하게 경화된 원표피층이다. 내원표피는 외원표피에 비하여 색소화나 경화가 비교적 덜 이루어진 층으로 주로 탈피 이후에 생성되는 부분이다(Muthukrishnan et al., 2020;Noh et al., 2017;van de Kamp et al., 2016). 딱정벌레 성충의 단단한 표피에는 외원표피와 내원표피 사이에 중원표피(mesocuticle)가 존재한다(Fig. 1B)(Cheng et al., 2009;Noh et al., 2016, 2017).

    곤충 표피의 주요 구성 물질로는 구조 큐티클 단백질(structural cuticular proteins)들과 키틴(chitin)이 있다. 키틴은 외피와 외표피에는 발견되지 않으며, 주로 원표피에서 발견된다(Moussian et al., 2006;Muthukrishnan et al., 2022, 2020; Noh et al., 2017). 키틴을 함유한 표피는 단단하기 때문에 곤충이 성장하는데 많은 제약이 따른다. 그러므로 곤충은 주기적으로 원래 가지고 있던 오래된 표피(old cuticle)를 분해하고, 동시에 안쪽에는 새로운 표피(new cuticle)를 생성하여 다음 단계로 탈피가 이루어져야 한다. 본 종설에서는 곤충의 탈피 과정에서 오래된 표피의 키틴을 가수분해하는 chitinases (CHTs)와 산화적으로 절단하는 lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO)의 생리학적 기능과 최근 새롭게 제시된 키틴성 표피의 분해 기작에 대하여 소개하고자 한다.

    곤충의 chitinase (CHT)

    곤충의 chitinase (EC 3.2.1.14)는 glycoside hydrolase family 18 (GH18)에 속하는 효소로 N-acetylglucosamine의 homopolymer인 키틴의 β-1,4 glycosidic bonds를 가수분해하여 짧은 키토올리고머(chitooligomers)를 생성한다(Arakane and Muthukrishnan, 2010;Merzendorfer, 2013;Zhu et al., 2016). 1993년 Kramer 등에 의하여, Manduca sexta의 chitinase를 암호화하는 유전자의 염기서열 정보가 곤충에서는 처음으로 보고 되었다(Kramer et al., 1993). 이를 계기로 이후에는 많은 곤충에서 chitinase의 cDNAs가 클로닝되고, 유전자 수준에서의 기능 구명 연구가 활발히 이루어졌다. 유전체가 밝혀진 곤충들인 Tribolium castaneum, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, M. sexta, Bombyx mori 등에서 chitinase를 암호화하는 유전자들을 확보하여 계통과 도메인을 분석한 결과, group I 부터 X 그리고 group H를 포함하여 11개의 그룹으로 나뉘어진다(Fig. 2)(Chen et al., 2020;Rabadiya and Behr, 2024;Shippy et al., 2022;Tetreau et al., 2015;Xi et al., 2015). Group H에 속 하는 chitinase는 나비목 곤충에서 발견되는 것으로, 박테리아의 chitinase 유전자가 수평 전파된 것으로 추정하고 있다(Fig. 2)(Daimon et al., 2003;Tetreau et al., 2015). 최근에는 Diaphorina citri에서 PAN domain과 endonuclease domain을 가지고 있는 group PE에 속하는 chitinase도 발견되었다(Shippy et al., 2022). 이렇게 곤충에 존재하는 많은 chitinase들은 각각의 특징적인 도메인 구성을 가지고 있으며, 발달 시기와 조직 특이적 유전자 발현 양상도 다르게 나타나므로 각기 다른 생리학적 기능을 할 것으로 추정하고 있다(Chen et al., 2020;Muthukrishnan et al., 2022;Rabadiya and Behr, 2024;Shippy et al., 2022;Tetreau et al., 2015). 이들 중 곤충의 탈피액에서 발견되는 group I과 group II에 속하는 epidermal chitinases에 초점을 맞추어 설명하고자 한다.

    Group I과 group II chitinases의 도메인 구성과 효소 활성

    앞서 언급하였듯이 group I과 group II에 속하는 chitinases는 곤충의 탈피액에서 발견되는 효소이며, 그 효소학적 특성과 생리학적 기능이 잘 연구되어 있다. 곤충의 탈피 시 표피를 분해하는 데 관여하는 것으로 밝혀진 첫 번째 chitinase는 Group I에 속하는 CHT5이다. 대부분 곤충의 게놈에서 CHT5유전자는 1개가 발견되며, 도메인 구성은 N-terminal 부위에 신호펩타이드(signal peptide)가 존재하고, 1개의 GH18촉매 도메인(GH18 catalytic domain)과 C-terminal 부위에 1개의 carbohydratebinding module family 14 (CBM 14)에 속하는 키틴 결합 도메인(chitin-binding domain, CBD)을 가지고 있다(Fig. 3A). 예외적으로 A. gambiae, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Locusta migratoria, Nilaparvata lugens, Sogatella furcifera와 같은 일부 곤충에서는 2~4개의 group I CHT5 유전자가 존재한다(Li et al., 2015;Xi et al., 2015;Yang et al., 2021;Zhang et al., 2011).

    Group II에 속하는 chitinase인 CHT10은 분자량이 매우 큰 효소로서, N-terminal 부위에 신호펩타이드, 4~5개의 GH18 catalytic domain과 그리고 4~7개의 CBDs를 가지고 있다(Fig. 3A). GH18 family에 속하는 chitinases의 활성에는 active center의 motif II에 존재하는 2개의 aspartic acid (D)와 1개의 glutamic acid (E)로 이루어진 “DxDxE” 가 중요한 역할을 한다(Fig. 3B). 특히 이들 산성아미노산 중 glutamic acid는 양성자 공여체 역할을 하며, chitinase의 활성에 필수적인 역할을 한다(Lu et al., 2002;Watanabe et al., 1993). Motif II내의 세 개 주요 아미노산을 기준으로 CHT10의 경우 촉매 도메인이 비활성형과 활성형이 존재한다고 추정할 수 있다. 예를 들면, 딱정벌레인 T. castaneum과 Monochamus alternatus의 경우 N-terminal을 기준으로 첫번째와 두번째 촉매 도메인의 motif II가 비활성형이며, 세 번째부터 다섯번째는 활성형 촉매 도메인으로 추정할 수 있다 (Fig. 3). 또한, 나비목 곤충인 M. sexta의 경우 세번째와 네번째의 촉매 도매인은 활성형이며, 나머지는 비활성형임을 알 수 있다. 초파리의 경우 4개 중 두번째와 세번째의 촉매 도메인이 활성형으로 추정된다(Fig. 3). 이렇게 곤충 종에 따라서 조금씩 다른 형태지만, CHT10s의 경우 GH18 catalytic domain이 활성형과 비활성형이 혼재한다. 비활성형 촉매 도메인의 경우 효소 활성에 필수적 아미노산 잔기가 결여되었으나 키틴 섬유에 결합이 가능할 것으로 추정된다.

    탈피 과정에서 CHT5와 CHT10의 생리학적 기능

    Group I CHT5과 group II CHT10 유전자들의 생리학적 기능에 관한 연구는 다양한 곤충에서 광범위하게 이루어져 있다(Dittmer et al., 2022;Fukamizo and Kramer, 1985;Liu et al., 2018;Qu et al., 2014;Zhang et al., 2014). T. castaneum을 비롯한 많은 곤충에서 CHT5와 CHT10 유전자는 배아 시기부터 성충까지 모든 발생 단계에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 특히 후배자 발달 시기에는 탈피 기간에 주로 높게 발현되었다. 또한, T. castaneum, M. alternatus, Leptinotarsa decemlineata, B. mori, Ostrinia furnacalis와 같은 일부 곤충에서 CHT10 유전자가 CHT5보다 일찍 발현되는 것을 알 수 있었다(Chen et al., 2024;Lee et al., 2023;Qu et al., 2014, 2021). 이러한 연구 결과들을 통하여, 곤충에서 group I과 group II에 속하는 chitinase 유전자들이 발달 과정 동안 순차적으로 발현하는 양상이 잘 보존되어 있을 것으로 보이며, 이는 탈피 과정에서 표피를 분해하는 데 중요한 기능을 할 것으로 시사해 준다. 유전자침묵(RNA interference, 이후 RNAi) 실험을 통하여, 파리목, 나비목, 딱정벌레목, 메뚜기목 등의 다양한 곤충에서 CHT5와 CHT10이 탈피 과정에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다(An et al., 2023;Chen et al., 2024;Lee et al., 2023;Li et al., 2015;Li et al., 2022;Liu et al., 2022;Omar et al., 2019;Pesch et al., 2016;Su et al., 2016;Xi et al., 2015;Yang et al., 2021;Zhang et al., 2012;Zhang et al., 2021;Zhu et al., 2019;Zhu et al., 2008). 예 를 들면, RNAi를 통한 T. castaneum의 TcCHT5와 TcCHT10 유 전자들의 발현을 억제하였을 때 성충이 번데기의 표피를 벗어 내지 못하고 그 안에 갇혀 치사하는 탈피 저해 표현형을 보여주 었다(Fig. 4)(Kim et al., 2024;Zhu et al., 2008). 실제로 이들 유 전자의 감소가 표피의 분해에 영향을 주는지 투과전자현미경을 이용하여 분석한 결과, TcCHT5와 TcCHT10 유전자 발현이 억 제된 번데기의 오래된 표피가 정상적으로 분해되지 못하여, 키 틴성 laminae가 그대로 남아 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과는 M. alternatus에서 MaCHT5와 MaCHT10을 RNAi 하였을 때도 유사하게 나타났다(Lee et al., 2023). MaCHT5와 MaCHT10 유전자 발현이 억제된 유충과 번데기는 각각 번데기와 성충으로 탈피가 이루어지지 못하고 치사하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 번데기의 오래된 표피의 미세구조를 관찰한 결과, 내원표피가 분해되지 못하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 종합하였을 때, group I CHT5와 group II CHT10은 오래된 표피의 키틴성 laminae를 분해하여 곤충이 정상적인 탈피를 할 수 있도록 하는 데 필수적인 역할을 하는 것을 알 수 있었다(Kim et al., 2024;Lee et al., 2023).

    곤충의 Lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO)

    곤충의 탈피 과정에서 CHT5와 CHT10이 오래된 표피를 분해하여 탈피에 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있다. 곤충 표피의 키틴은 키틴 사슬이 역평행으로 배열된 매우 안정적인 형태인 α-키틴 결정 구조를 가지고 있다. 그러나 곤충 탈피액에 존재하는 chitinase는 표피의 결정성 α-키틴(crystalline α-chitin)을 분해하는데 낮은 활성을 가지고 있다. 그러므로 chitinase의 활성을 측정하는데 주로 콜로이드 키틴, 글리콜 키틴, 카르복시메틸 키틴과 같은 재생/팽창 또는 수용성 키틴 유도체들을 사용하고 있다. 그렇다면 표피에 존재하는 결정성 α-키틴은 탈피액에 포함된 CHT5와 CHT10에 의하여 어떻게 분해될 수 있을까? 최근 연구를 통하여, 곤충 표피에 존재하는 결정성 α-키틴을 효과적으로 분해하는데 lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO, EC 1.14.99.53/54/55/56)가 중요한 역할을 한다는 것이 새롭게 밝혀졌다. LPMO는 구리 의존성 효소로서 환원제와 산소의 존재 하에서 결정성 다당류의 glycosidic bonds를 산화적으로 절단할 수 있다는 것이 보고된 바 있다 (Forsberg et al., 2019). LPMO 유전자는 바이러스, 미생물(박테리아, 곰팡이, 고세균, 조류), 고등동물(침엽수, 연체동물, 절지동물) 등에서 다양한 생물체에서 광범위하게 발견되고 있다 (Agostoni et al., 2017;Chylenski et al., 2019;Forsberg et al., 2019;Sabbadin et al., 2018). 이들 LPMOs는 Carbohydrate- Active enZYmes (CAZy, http://www.cazy.org)에서 'Auxiliary Activity (AA) enzyme families'로 분류되며, 현재 AA9(구 당 가수분해효소 family 61, GH61), AA10(구당 결합 모듈 family 33, CBM33), AA11, 그리고 AA13-AA17까지 총 8개의 AA family가 존재한다(Couturier et al., 2018;Filiatrault-Chastel et al., 2019;Hemsworth et al., 2014;Langston et al., 2011;Lo Leggio et al., 2015;Sabbadin et al., 2021;Vaaje-Kolstad et al., 2010). 곤충에서는 2018년에 원시 곤충인 Thermobia domestica (Td)에서 처음 보고되었으며, AA15 family (이하 LPMO15)로 분류되었다(Sabbadin et al., 2018). 이후 유전체가 밝혀진 일부 곤충에서 LPMO15 family 단백질들을 계통 분석 한 결과, LPMO15은 group I에서 IV까지 최소 4개의 subgroups으로 나 누어지는 것을 알 수 있었다(Fig. 5)(Qu et al., 2022a). 곤충에서 Group I과 II에 속하는 LPMO15 유전자는 각각 1개씩 존재하 고, group III의 경우 종에 따라서 1~7개까지 다양하다. Group III의 경우 나비목 곤충의 LPMO15가 포함되어 있지 않고, 대신 group IV는 나비목 LPMO15으로만 구성되어 있었다(Qu et al., 2022a). 네 그룹에 속하는 LPMO15 단백질들의 도메인 구조를 확인한 결과, 이들 모두 signal peptide와 AA15 catalytic domain 이 존재하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5). Group I LPMO15-1s의 경우 C-terminal 부위에 잘 보존된 6개의 cysteines이 있는 모티 프인 C-X15-C-X3-C-X6-8-C-X4-C-X1-C 서열이 두 번 반복되었다. 이 모티프는 chitinase에서 발견되는 6개의 cysteines이 있는 CBD와 cysteine 배열과 1차 구조의 유사성이 없으나 당 결합 모듈로 추정되며 아직 그 기능은 밝혀진 바 없다. 반면, group II LPMO15-2s는 이 모티프가 존재하지 않고, 대신 transmembrane span을 가지고 있었다. 또한, 소화관인 소낭의 프로테옴 분석에서 21개의 TdLPMO15s은 다른 곤충의 LPMO15s과는 구별되는 독자적인 그룹을 형성하고 있었다(Qu et al., 2022a;Sabbadin et al., 2018).

    곤충의 LPMO15s의 효소 특성

    LPMO15의 효소 활성은 T. domestica의 TdAA15A와 TdAA15B (Sabbadin et al., 2018), Coptotermes gestroi의 CgAA15a (group III)와 CgAA15b (group II) 및 O. furnacalis의 Of- LPMO15-1 (group I)와 같은 일부 곤충에서 확인된 바 있다 (Franco Cairo et al., 2021;Qu et al., 2022a). T. domestica의 TdAA15A 재조합 단백질은 외부 전자 공여체가 존재할 때 키틴과 셀룰로스 모두 분해할 수 있는 효소 활성을 가지고 있었다. 특히, GH18 chitinase와 함께 더욱 효과적으로 키틴을 분해할 수 있었으며, 셀룰로스를 분해할 때는 GH6 (cellobiohydrolase), GH7 (endoglucanase), GH9 (endoglucanase), GH1 (β-glucosidase)과 함께 시너지 효과를 보여주었다(Sabbadin et al., 2018). 반면, TdAA15B 재조합 단백질은 키틴에 대해서만 효소 활성을 보여주었으며, C1 부위의 산화물을 생성한다. C. gestroi의 CgAA15a와 CgAA15b 재조합 단백질들은 키틴을 분해할 수 있는 효소 활성을 가지고 있었지만, 셀룰로스, 자일란, 자일로글 루칸 또는 전분에 대한 효소 활성은 보여주지 않았다(Franco Cairo et al., 2021). O. furnacalis의 재조합 OfLPMO15-1 단백 질도 키틴만을 특이적으로 절단하는 효소 활성을 가지고 있으며, group H chitinase (GH18)와 함께 더욱 높은 키틴 분해 활성을 보여주었으며, 역시 C1 산화물을 생성하는 것으로 추정된다 (Qu et al., 2022a). 이처럼 LPMO15 재조합 단백질들이 키틴을 절단할 수 있는 효소 활성이 있다는 것을 통하여, 곤충에서 LPMO15가 키틴을 리모델링하는 데 중요한 역할을 할 것으로 추정할 수 있다(Franco Cairo et al., 2021;Qu et al., 2022a, 2022b;Sabbadin et al., 2018).

    곤충의 탈피 과정에서 LPMO15−1s의 생리학적 기능

    LPMO15 유전자들의 생리학적 기능에 관한 연구는 일부 곤충을 제외하고 대부분의 곤충에서 이루어지지 않았다. 유전자 발현 양상을 기반으로 T. castaneum, L. migratoria, 그리고 B. mori에서 group I LPMO15-1은 표피와 기관(trachea)과 같은 키틴성 조직에서 주로 발현하고 중장에서는 거의 발현되지 않았다(Kong et al., 2025;Qu et al., 2022a, 2022b). Group II LPMO15-2의 경우 표피 조직과 생식 기관에서 발현을 보여주 었던 반면, group III LPMO15-3과 나비목 특이적 group IV LPMO15-4의 일부 유전자는 중장 조직에서 주로 발현되는 것을 알 수 있었다(Qu et al., 2022a;2022b). 이를 통하여 group I LPMO15-1은 표피와 기관의 키틴 분해에 중요한 기능을 하고, group III LPMO15-1과 일부 group IV LPMO15-4는 중장 내에 존재하는 키틴성 위식막(peritrophic matrix)을 분해하거나 먹이에 함유된 키틴을 분해하는 데 중요한 역할을 할 것으로 추정 할 수 있다. 그러나 곤충에서 LPMO15s의 생리학적 기능에 대한 연구는 T. castaneum과 L. migratoria의 group I LPMO15-1과 L. migratoria의 group III LPMO15-3을 제외하고 거의 이루어 지지 않았다. 본 종설에서는 표피의 키틴 분해 과정에서 group I LPMO15-1의 생리학적 기능에 대하여 살펴보고자 한다.

    최근 RNAi 실험 기법 등을 이용하여, T. castaneum과 L. migratoria에서 group I LPMO15-1이 탈피 과정에서 표피의 키틴 분해에 중요한 역할을 한다는 것이 보고되었다(Qu et al., 2022a). T. castaneum 의 LPMO15-1 (TcLPMO15-1) 유전자는 알에서 성충까지 모든 발달 단계에서 발현되었다. 흥미롭게도 탈피 시기에는 LPMO15-1 유전자의 발현 양상이 TcCHT10 유전자의 발현과 유사한 양상을 보여주었으며, TcCHT5보다는 일찍 발현되는 것을 알 수 있었다(Qu et al., 2022a;Zhu et al., 2008). RNAi를 이용하여 TcLPMO15-1 유전자의 발현을 억제하였을 때, dsRNA를 주사한 시기에 따라 유충이 다음 단계 유충으로, 유충이 번데기로, 그리고 번데기가 성충으로 탈피하는 것이 저해되는 표현형을 보여주었다(Fig. 4). 투과전자현미경을 이용한 표피의 미세구조를 분석한 결과, TcVer-control dsRNA 를 처리한 T. castaneum의 유충, 번데기에서는 오래된 표피의 내원표피가 정상적으로 분해된 반면, TcLPMO15-1의 dsRNA 를 처리한 곤충의 내원표피는 잘 분해되지 않고, 탈피 전과 유사한 상태로 남아있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이처럼 TcLPMO15-1 유전자의 기능을 억제한 곤충은 오래된 표피 분해가 정상적으로 이루어지지 못하게 되어 탈피를 실패하는 것으로 알 수 있었다. 이와 유사하게, L. migratoria에서 LPMO15-1 (LmLPMO15-1) 유전자의 dsRNA를 5령 약충에 주사하여 RNAi 하였을 때, 오래된 표피의 정상적인 분해가 이루어지지 못하여 성충으로의 탈피가 저해되는 표현형을 보여주었다(Qu et al., 2022a). 이러한 연구 결과로부터 탈피액에 존재하는 chitinolytic enzymes과 함께 group I에 속하는 LPMO15-1도 곤충의 탈피 시 오래된 표피를 분해하는 데 필수적인 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

    곤충의 새로운 탈피 조절 기작

    지금까지 연구된 결과들을 종합하여, 곤충의 표피 내 키틴이 분해되는 과정과 새로운 탈피 기작을 다음과 같이 제안해 본다. 먼저 원래 가지고 있던 표피층이 표피세포에서 떨어져 나오는 표피층 분리가 일어난다(apolysis). 이후 단백질분해효소들에 의하여 오래된 표피의 큐티클 단백질(structural cuticular proteins)들이 분해되고 결정성 키틴이 노출된다. 이후 과정은 Fig. 6에서 보는 바와 같이, LPMO15-1이 노출된 키틴 섬유의 결정 표면을 산화적으로 절단하여 새로운 말단 부위를 제공하면서 부분적인 탈결정화를 일으킨다. 이 부분에 여러 개의 키틴 결합 도메인과 비활성형 촉매 도메인을 가진 CHT10이 결합하여 키틴 섬유가 떨어져 나오게 하는 층간박리(delamination)가 일어난다(Fig. 6의 화살표). 이후 CHT10의 활성형 촉매 도메인과 후발현되는 CHT5에 의하여 키틴 사슬이 키토올리고당으로 가수분해된다. 최종적으로 키토올리고당은 N-acetylglucosaminidases (NAG)에 의하여 단량체인 N-acetylglucosamine으로 분해된다. 이러한 과정들이 반복되면 곤충의 오래된 표피의 내원 표피가 분해되어 정상적인 탈피를 할 수 있게 되는 것이다. 이 가설을 확인하기 위해서 CHTs와 LPMO15-1의 표피 내 단백질 분포 양상 등에 대한 추가적인 단백질 수준의 연구가 필요할 것으로 사료된다.

    표피 분해의 생리 및 생화학적 과정을 겨냥한 해충 방제 응용

    표피의 분해와 생성은 곤충이 탈피하는 동안 매번 이루어지는 필수적 생리 과정이며, 곤충과 절지동물에서 볼 수 있는 특징이다. 그러므로 이들만의 특이적 현상인 탈피 과정을 저해할 수 있다면 비표적 생물체에는 영향이 적고 해충만을 선택적으로 방제하는데, 좋은 방안이 될 수 있을 것이다. 이러한 측면에서 본 종설에서 언급한 chitinases와 LPMO15-1s과 같은 유전자나 단백질들을 겨냥하여 해충 방제에 활용하면 표피 분해과정이나 탈피를 저해하여 효과적으로 해충을 방제하는 데 활용할 수 있을 것이다. 현재 chitinases의 효소 활성을 억제할 수 있는 다양한 화학물질을 발굴하는 연구는 활발히 진행되고 있다(Andersen et al., 2005;Chen et al., 2020;Chen and Yang, 2020;Liu et al., 2014;Saguez et al., 2008;Zhao et al., 2022;Zhu et al., 2021). 예를 들면, allosamidine과 그 유도물질(derivatives)들은 chitinases를 억제하는 활성을 가지고 있어, hemipteran과 lepidopteran 곤충 종 등에서 살충 효과를 보여주는 것이 확인된 바 있다 (Andersen et al., 2005;Blattner et al., 1996;Saguez et al., 2006;Sakuda et al., 1987). 곰팡이에서 추출된 argadin과 argifin은 Lucilia cuprina에서 chitinase활성을 억제하여 탈피가 저해되고 살충 효과가 확인되었다(Arai et al., 2000;Omura et al., 2000). LPMOs의 효소 활성을 억제할 수 있는 물질에 관한 일부 연구가 미생물에서 이루어졌다. 예를 들면, Chinese cinnamon 인 Cinnamonum cassia의 추출물이 균류인 Lentinus similis의 AA9 family의 isoform A인 AA9A LPMO (LsAA9A)에 대한 억제 효과가 있다는 것이 보고된 바 있다(Tokin et al., 2021a;2021b). LsAA9A는 셀룰로스, 자일로글루칸, 글루코만난 , 자일란 및 자일로헥사오스와 같은 다당류를 분해할 수 있으며, 기질과 결합된 단백질 결정 구조가 밝혀졌다(Frandsen et al., 2016;Simmons et al., 2017). 이와 반면에, 곤충에서 발견되는 LPMO15s를 억제 물질은 아직까지 보고된 바 없다. LPMO15s 는 LsAA9A와 같이 구리 이온이 결합할 수 있는 histidine brace를 가진 촉매 부위와 기질 결합 부위 등 대부분의 LPMO 단백질에서 볼 수 있는 특징을 잘 가지고 있어, 단백질의 구조는 유사할 것으로 추정된다. 그러나 균류의 LsAA9A과 같이 미생물의 LPMOs가 키틴을 제외한 다양한 다당류를 분해하는 것과는 다르게, 곤충의 LPMO15s는 키틴을 특이적으로 분해하여 기질에 대한 특이성이 다른 것으로 추정된다(Qu et al., 2022a;Simmons et al., 2017). 따라서, 곤충의 LPMO15s 효소를 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 확보하기 위해서는 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

    최근에는 기존의 화학적 방제에 대한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 RNAi 기술을 해충방제에 활용하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다(Fletcher et al., 2020;Kim, 2017;Yoon et al., 2022;Zhu and Palli, 2020). RNAi는 유전자의 염기서열을 기반으로 특이적 유전자 발현을 억제하는 기술로서 선택적인 해충을 방제하고 화학 농약을 대체하는 새로운 수단으로 인정 받고 있다. RNAi기술을 활용한 해충방제제를 개발하기 위해서는 곤충의 생존이나 발달 과정을 조절할 수 있는 필수적 유전자들을 선발하는 것도 중요하다. 이러한 측면에서 곤충의 탈피 과정에 필수적인 chitinases와 LPMO15-1s과 같은 유전자들을 겨냥하면 탈피 과정을 저해하고, 생장 및 발달을 억제하여 높은 살충 효과를 지닌 RNAi 기반 해충 방제 후보 유전자로 활용할 수 있을 것으로 기대된다(Kottaipalayam-Somasundaram et al., 2022;Zhu et al., 2016). 더불어 곤충의 탈피 과정이나 이에 필수적인 chitinases와 LPMO15-1s 유전자의 생리학적 기능은 곤충과 절지동물에서 잘 보존되어 있으므로, 유전자의 염기 서열을 기반으로 해충방제제를 개발한다면 특정 해충을 선택적으로 방제하는 데도 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

    Acknowledgements

    본 리뷰 논문을 검토해주신 전남대학교 한연수 교수님께 깊은 감사드립니다. 본 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구입니다(RS-2024-00345424 및 RS-2025-00555368).

    Supplementary Information

    Supplementary data are available at Korean Journal of Applied Entomology online (http://www.entomology2.or.kr).

    저자 직책 & 역할

    • Yasuyuki A.:전남대, 교수; 자료 수집, 실험 설계 및 결과 분석, figure 제작 및 수정, 논문 작성 및 수정

    • 노미영:전남대, 교수; 자료 수집, 실험설계, 실험 수행 및 결과 분석, figure 제작 및 수정, 논문 작성 및 수정

    모든 저자는 원고를 읽고 투고에 동의하였음.

    Figure

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    Schematic diagrams of the ultrastructure of flexible larval and rigid adult cuticles of T. castaneum. Both relatively flexible larval (A) and rigid adult cuticles (B) are composed of several morphological distinct layers including the envelope (EN), epicuticle (EP), exocuticle (EXO) and endocuticle (ENDO). The last two layers comprise the procuticle (PRO), which consists of many chitinous horizontal laminae and vertical pore canals (PC). In the adult cuticle, the PCs contain chitin fibers denoted as pore canal fibers (PCF), and the mesocuticle (MESO) layer formed between the EXO and ENDO is evident.

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    Phylogenetic analysis of insect chitinases and chitinase-like proteins. ClustalW software was used to carry out the multiple sequence alignment prior to phylogenetic analysis. MEGA7 software (Kumar et al., 2016) was used to construct the phylogenetic tree using the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) methods. Numbers by each branch indicate results of bootstrap analysis from 1000 replications. Groups I (CHT5) and II (CHT10) are highlighted in green. T. castaneum (Tc), D. melanogaster (Dm), A. mellifera (Am), A. gambiae (Ag), M. sexta (Ms) and B. mori (Bm). See Supplementary Table S1 for the accession numbers of chitinases and chitinase-like proteins used for this analysis.

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    Domain organization and comparison of conserved motif II in catalytic domains of CHT5s and CHT10s from T. castaneum, M. alternatus, M. sexta and D. melanogaster. (A) The protein domains of group I CHT5s and group II CHT10s from T. castaneum (Tc), M. alternatus (Ma), M. sexta (Ms) and D. melanogaster (Dm) were analyzed by ExPASy PROSITE program. The two spliced isoforms of MaCHT10, MaCHT10a and MaCHT10b, are shown. DmCHT10 lacks one GH18 catalytic domain and a chitin-binding domain (CBD) corresponding to the most N-terminal ones in other CHT10s analyzed. (B) Comparison of the conserved motif II in the GH18 catalytic domains of CHT5s and CHT10s. The motif II in all group I CHT5s analyzed are completely conserved, in which all three catalytically critical acidic amino acids, two aspartates and one glutamate are present. In CHT10s, the third and fourth GH18 domains are apparently active (magenta boxes), while the first and second GH18 domains are predicted to be inactive (gray boxes) because substitutions of the aspartate (D to H/A, blue letters) and/or glutamate (E to N/Q; red letters) in the motif II. Unlike that seen in TcCHT10 and MaCHT10s, the fifth and fourth GH18 domains in MsCHT10 and DmCHT10, respectively, are also presumably inactive. See Supplementary Table S1 for the accession numbers of chitinases and chitinase-like proteins used for this analysis.

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    Lethal pupal-adult molting defect phenotypes produced by RNAi for TcCHT5, TcCHT10 and TcLPMO15-1. Injection of dsRNA for either TcCHT5 (dsTcCHT5), TcCHT10 (dsTcCHT10) or TcLPMO15-1 (dsTcLPMO15-1) into young pupae had no effect on pupal growth. However, all of them failed subsequent pupal-adult molting and died entrapped in their pupal exuviae. TEM analysis revealed degradation of the endocuticle in the old pupal cuticle collected from dsTcVer-treated control pharate adults (dotted bracket), whereas those of dsTcCHT5-, dsTcCHT10- and dsTcLPMO15-1-treated insects were essentially intact, retaining numerous horizontal chitinous laminae and vertical pore canals (solid brackets). EN, envelope; EP, epicuticle; EXO, exocuticle; ENDO, endocuticle; PC, pore canals.

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    Phylogenetic analysis of insect LPMO15s. MEGA7 software (Kumar et al., 2016) was used to construct the phylogenetic tree of LPMO15s from T. castaneum (Tc), D. melanogaster (Dm), A. mellifera (Am), N. vitripennis (Nv). A. gambiae (Ag), M. sexta (Ms), B. mori (Bm), Helicoverpa armigera (Ha), O. furnacalis (Of), and L. migratoria (Lm) using the UPGMA methods. Numbers by each branch indicate the results of bootstrap analysis of 1000 replications. Domains of each group LPMO15s are also shown.

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    Proposed molecular mechanism of chitin degradation by LPMO15-1 and molting fluid chitinolytic enzymes during molting. During each molting cycle, the old cuticle is separated from the epidermal cells called apolysis, and then the new cuticle begins to form simultaneously with degradation of the inner part of chitinous old cuticle. Our hypothesis on the synergistical digestion of chitin in the old cuticle by LPMO15-1 and the molting fluid chitinolytic enzymes such as CHT5, CHT10 and NAG is shown. C1-oxidized N-acetylglucosamines in new ends of chitin fibers produced by LPMO15-1 are indicated in green. Delaminated chitin fibers are indicated by red arrows.

    Table

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation Korean J. Appl. Entomol.
    Frequency Quarterly
    Doi Prefix 10.5656/KSAE
    Year of Launching 1962
    Publisher Korean Society of Applied Entomology
    Indexed/Tracked/Covered By